題目：上皮和基質角膜硬度的變化隨年齡和肥胖而發(fā)生

（如果需要完整文獻請與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）

簡介：

角膜是無血管的，這使其成為研究基質蛋白表達和組織硬度的模型。角膜上皮粘附在基底區(qū)，下面的基質由角質細胞和廣泛的膠原蛋白和蛋白聚糖基質組成。我們的目標是檢查8周和15周小鼠的角膜變化，并將其與15周前2型糖尿病肥胖小鼠進行比較。對角膜上皮進行納米壓痕原位，然后對上皮進行磨損，并在基底膜和基質上重復該過程。進行共聚焦成像以檢查蛋白質的定位。發(fā)現(xiàn)僵硬取決于年齡和肥胖。與8周小鼠相比，15周小鼠上皮的楊氏模量更大。在15周時，對照組的上皮明顯大于肥胖小鼠的上皮。Crb3和PKCζ在頂端上皮的定位存在差異，肥胖小鼠缺乏片狀延伸。在2型前糖尿病肥胖小鼠中，硬度斜率存在差異，損傷后纖連蛋白的定位可以忽略不計。這些表明，飲食引起的年齡和環(huán)境變化會隨著年齡的增長而改變組織的完整性，使其更僵硬。來自2型前糖尿病肥胖小鼠的角膜明顯較軟，這可能是由于頂端表面蛋白質的變化表明缺乏完整性和纖連蛋白減少。

2. 材料和方法

2.3. 納米壓痕

角膜上皮和基質硬度用Piumanano壓痕系統(tǒng)（Optics11，阿姆斯特丹，荷蘭）測量。為了進行測量，頭部被固定。將眼睛浸入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并將探針降低到角膜的中心。探頭的半徑為26μm，剛度為4.4 N / m。通過10μm壓痕進行上皮測量。

為了檢查基底膜和基質，對上皮進行了磨損。使用各種壓痕深度進行測量，范圍從1μm到17μm。使用基于赫茲接觸力學模型的內置PIUMA軟件計算樣品的楊氏模量，假設角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。加載曲線通過軟件擬合到以下方程中：其中F表示施加的力，表示有效楊氏模量，表示球尖半徑，并表示壓痕深度。我們用于分析的體積楊氏模量是使用以下公式生成的：其中表示被測材料的泊松比。

3. 結果

3.1. 僵硬取決于年齡和肥胖

在接下來的實驗中，我們將8周和15周的小鼠與天然發(fā)生的小鼠肥胖模型（2型糖尿病小鼠前）進行了比較，以檢查上皮和基質硬度的變化。使用來自5只8周對照小鼠，5只15周對照小鼠和2只DiO 15周齡小鼠的雙眼。之前，我們證明了肥胖小鼠角膜的角膜上皮傷口修復受損[]。這些結果刺激我們檢查角膜的變化，這可能是細胞遷移和傷口修復變化的根本原因。在中，我們檢查了完整眼睛中上皮，基底膜和基質的硬度。計算Young氏模量，15周C57Bl6小鼠的完整角膜上皮顯著大于8周小鼠的完整角膜上皮（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0.01）。在同等年齡時，上皮顯著大于年齡匹配的DiO小鼠角膜（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0. 01）。在這里，小鼠的背景相似，DiO小鼠被喂食高脂肪飲食15周。

圖1.8周對照的角膜上皮硬度（平均值±標準差），假設角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。

4.4. 討論

角膜是的，因為它作為眼睛的折射表面發(fā)揮著基本功能，同時也在眼睛和外部環(huán)境之間保持了不透水的屏障。我們已經表明，僵硬的變化隨著年齡的增長以及肥胖小鼠（DiO）而發(fā)生，這是II型糖尿病前期的模型。之前，我們證明了DiO小鼠的角膜愈合速度明顯慢于對照C57BL6小鼠的角膜[]。我們在本手稿中的數據支持一份報告，即與對照組相比，糖尿病前期患者的角膜表面疾病發(fā)病率增加（分別為20.67%和3.33%;p < 0.05） ]。

我們證明，年齡匹配的動物的上皮硬度與年齡和飲食有關。由于DiO動物的上皮不那么堅硬，我們反映了上皮完整性的變化，并對頂端上皮中常見的極性蛋白進行了染色。我們檢查了未受傷和受傷的角膜，因為平面極性可以通過幾種不同的線索引發(fā)，包括生長因子和/或細胞外基質的變化[。這些線索被認為被轉化為定向遷移，這需要通過信號通路重組細胞成分。這些蛋白質通常局限于遷移細胞的前部，導致細胞骨架變化，前緣膜突起和定向運動。這些變化在對照中觀察到，并在DiO角膜中被修改。先前，在其他組織中發(fā)現(xiàn)Crb3在分化的分泌細胞和分化的纖毛細胞中定位于頂端表。

在基底膜和基質中也檢測到剛度的差異，通過基質的剛度變化百分比發(fā)生變化。所有測量均在中央角膜中進行。剛度變化的原因尚不清楚[]。表明隨著年齡的增長，結締組織的特征是晚期糖基化終產物（AGEs）的積累，并且糖尿病患者受其積累的影響更大。這很重要，因為它可以改變基質中豐富的蛋白質（如膠原蛋白）的糖基化。他們對體外肌腱的研究表明，AGEs會降低組織的粘彈性。關于AGEs隨時間積累及其對膠原纖維和蛋白聚糖間距的影響的數據尚不清楚。

在最近的一篇綜述中，McKay等人指出，膠原蛋白交聯(lián)提供了維持角膜完整性的強度，衰老和糖尿病與膠原交聯(lián)的增加有關[]。然而，該評價隨后指出，雖然糖尿病人群的角膜滯后和角膜阻力因子升高，但存在不一致之處，他們提出這是由于人類患者群體的異質性。糖尿病人群中的一致性極難控制，原因包括疾病的嚴重程度和持續(xù)時間。出于這個原因，隨著時間的推移，對幾種不同的小鼠糖尿病模型的研究將很有趣，以解決這個問題。McKay確實報告了基質厚度增加，根據研究的不同，剛度沒有或中度增加。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)DiO角膜Kneer等人（2018）的基質厚度增加。

其他研究者假設這種增加與糖尿病有關，并發(fā)現(xiàn)在其隊列中，LOX與糖尿病或肥胖無關[]。雖然我們測量了僵硬，但我們沒有測量LOX，需要在飲食的不同時間在DiO小鼠中檢查其表達。事實上，他們的體外研究表明，升高的LOX與缺氧的關聯(lián)更大。此外，Mankus等人（2012）在P2X7敲除小鼠中證明，LOX與III型膠原蛋白一樣升高，并不表示交聯(lián)增加[]。然而，在DiO小鼠和糖尿病人角膜中，P2X7 mRNA顯著升高7-10倍[]。這種升高表達的功能含義尚不清楚。在我們目前的研究中，沒有進行膠原纖維測量，未來的研究將進一步檢查基質的細胞外基質。蛋白聚糖的硫酸化可能會發(fā)生變化，因為這也可能影響剛度。

我們的研究表明，DiO角膜傷口愈合受損可能反映了硬度的差異或基質分子（如纖連蛋白）的變化。在對照中，與DiO角膜相比，沿著基質神經和對照前緣檢測到纖連蛋白。缺氧角膜中檢測到纖連蛋白減少，與對照組相比，角膜愈合延遲。甚至有可能缺乏順應性反映了纖連蛋白的減少，因為體外研究表明，纖連蛋白的拉伸會導致其展開，導致隱秘結合位點暴露[]。納米壓痕儀在不同年齡和環(huán)境壓力下對相同背景的小鼠的使用為具有許多相互矛盾數據的領域提供了對照研究，因為人類模型非常復雜。隨著時間的推移，將對肥胖和非肥胖小鼠的2型糖尿病模型進行其他研究，以進一步測試我們的結果。識別改變角膜完整性的特定因素將用于治療和預防變化?？傊芯拷悄さ奈锢硖卣鳎缭唤┯玻梢陨钊肓私饪刂坪突疾l件下傷口修復的機制。

生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動平臺上極其敏銳的壓痕探頭
1.壓痕移動平臺，具備粗進以及精進兩級移動精度，使得探針可以自動尋找到表面并且提供高精度壓痕。除了壓痕移動平臺，Piuma納米壓痕儀還有一個手動樣品移動平臺
2.方便樣品的安放。你的樣品可以放在X-Y移動臺上Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

3.進行楊氏模量的測試或者進行多點陣測試。一個內置式的顯微鏡
4.可以直接觀察實驗過程！Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

生物組織納米壓痕儀是一個簡單易用的革命性產品，為軟物質以及生物材料組織的微觀以及納觀研究帶來希望。依靠自身*的新型光學技術以及杰出的微加工工藝，Piuma納米壓痕儀可以測量楊氏模量軟的樣品，范圍甚至是從5Pa到5GPa!Piuma同樣非常適合在液體中測試樣品。其操作非常簡單易學，只需將探頭插入儀器中，簡單定標后，即可馬上開始壓痕實驗。

產品構件詳細介紹：
1.PROBE探頭
納米壓痕儀核心:一個微加工工藝制作的光學壓痕探頭
2.SAMPLE樣品
從水凝膠到骨組織等，在大氣中或者浸沒在液體中
3.SAMPLEXYSTAGEXY樣品臺
在X-Y（12x12mm）范圍內測試樣品
4.INDENTATIONSTAGE壓痕移動臺
粗進以及精進移動臺實現(xiàn)精確壓痕以及自動尋找樣品表面
5.MANUALSTAGE手動平臺
為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間

納米以及微米級別的生物機械性能

Piuma是一個創(chuàng)新的，具有成本效益的工具，用來表征生物材料、組織、細胞器、細胞層、軟骨、靜電支架、力學性能，3D打印材料，水凝膠等的微納米機械性能。

The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求，提供易用性和便攜性，同時提供高精度、高通量和多樣化的數據。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭，特別適合在液體中測量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學的研究者，Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個解決方案。 

軟物質材料表征

在生物材料、組織工程、再生醫(yī)學和醫(yī)學研究領域，Piuma可以在溶液里進行非破壞性測量測量某點或者某個區(qū)域的楊氏模量、蠕變和松弛實驗，點陣測量粘附力，描述應變硬化行為，樣品的粘度等。測試生物材料和組織樣本的軟硬度可以很容易地在Piuma納米壓痕儀上用其optics11 PIUMA探頭和專用的Piuma軟件來實現(xiàn)。 

Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細胞等軟物質以及生物材料的機械性能研究。采用了新型探頭設計，彌補了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無法測試軟物質的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質測試中的數據波動大，操作困難、制樣嚴苛等常見問題。更開創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動態(tài)力學測試模式DMA，可以獲得材料與振動頻率相關的儲存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學損耗。

如您對此感興趣，我們可以為您提供試樣服務。